石棉表面改性对石棉诱导人胚肺细胞产生羟基自由基的影响
发表日期：2011-05-04 09:39:00 来源：互联网; 点击次数：
0 引言
随着石棉的广泛应用及其对环境的污染，其对人体健康的危害也逐渐引起人们的重视。人类流行病学调查和动物实验均已证实，长期接触石棉纤维，不仅可致肺纤维化(石棉肺)，而且可致支气管肺癌、胸膜和/或腹膜恶性间皮瘤。有研究报道，接触石棉还可能与胃肠癌、肝癌、喉癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤的发生有关。甚至有调查发现，女性接触石棉者，其卵巢和子宫恶性肿瘤的发生率也有所增高，并证实其卵巢组织中存在石棉纤维。
有学者估测，1985-2009年的25年间，仅美国即有13万余人将死于与石棉有关的癌症。1987年，国际癌症研究机构(IARC)已将石棉列入人类确定致癌物之一。
由于石棉的潜在危害，各国政府对石棉的开采和应用已采取了多种措施。部分发达国家已提议禁用或限用石棉，而致力于寻求低毒的天然矿物纤维和/或人造矿物纤维(MMMF)来代替石棉。但近年来对石棉代用品——MMMF的生物学作用研究发现，MMMF也有致纤维化和致肿瘤的可能。由此表明，迄今为止世界上尚无真正有效地阻止或减少石棉致癌的措施或办法。
我国矿产资源丰富，为世界第三石棉生产大国，随着经济的迅速发展，国内使用量和对外输出石棉加工产品的需求也正在与日俱增，而我国现有石棉代用品的品种和产量也远不能满足实际的需要，而且部分作业还不能使用石棉代用品，因此，禁止生产和使用石棉在我国短期间内亦难以实行。
通过近年的实验研究发现，采用化学或物理作用对石棉表面进行改性处理，以降低其致病活性问题业已证明为可能，从而为预防和减轻石棉对人体健康的危害开辟了一条新的重要途径。笔者在前期研究的基础上，重点观察了用柠檬酸铝、混合稀土或亚硒酸钠预处理温石棉对石棉诱导人胚肺细胞产生羟基自由基的影响。
1 材料与方法
1 细胞培养
用含体积分数为10%的小牛血清和青霉素、链霉素的低限量Eagle培养基(MEM)于37℃，5%CO2的条件下培养人胚肺(HEL)细胞，用质量分数为0.125%的胰蛋白酶＋质量分数为0.01%的EDTA消化传代，3d传代1次。
1.2 石棉纤维的制备
采用国产茫崖温石棉(CH)纤维，用磷酸盐缓冲液(BPS)配成不同浓度的混悬液，经超声分散和充分振荡混匀后备用。石棉纤维分散度为：<5μm者占9%；5~10μm者占46%；10～20μm者占34%；>20μm者占11%。直径<0.2μm者占95%，偶见较粗的纤维束。
1.3 其他化合物
混合稀土由中国农用稀土中心提供，为稀土硝酸盐，分子式为R(NO3)3·6H2O，稀土元素含量以氧化物计：La2O3占27%~28%，CeO2占50%，Nd2O3占15%～17%，Pr6O11占5%～6%，其他11种元素合计占约1%。柠檬酸铝由北京医科大学药厂生产，含铝量约9.3%。亚硒酸钠为北京市朝阳区中联化工试剂厂产品，分析纯，含亚硒酸钠不少于98.0%。
1.4 石棉纤维的预处理
将一定量的温石棉纤维悬液与不同浓度的混合稀土、柠檬酸铝或亚硒酸钠溶液相混后，分别在室温下作用1小时，21300转/分离心10分钟，弃去上清液后，再用PBS将下部沉淀配成一定浓度均匀的混悬液。
1.5 羟基自由基(OH)的测定(ESR自旋捕获法)
取20μ2.5×107/ml的细胞，加入不同浓度的温石棉悬液或经浸泡过的温石棉悬液20μl，DPMPO10μl，37℃温育10分钟，混匀，吸入石英毛细管中，于ESP-300型波谱仪上检测OH信呼。标准OH产生体系为：10%H2O2μl，1mmol/L FeSO410μl，去离子水10μl，1mol/LDMPO10μl。测定条件：中心磁场3 500 G，扫描宽度200 G．调制幅度2.05e＋00G，，扫描时间为4分钟，功率为10mW。
1.6 统计分析方法
用SPSS软件对数据进行统计分析。抑制率=(未处理石棉组所测值一处理后石棉组所测值)÷(未处理石棉组所测值对照组所测值)。
2 结果
2.1 石棉诱导人胚肺细胞产生羟基自由基
不同剂量温石棉诱导人胚肺细胞产生的羟基自由基强度如表1所示。
表1 不同剂量温石棉诱导人胚肺细胞产生的羟基自由基
由表1可见，随着温石棉染毒剂量的升高，人胚肺细胞所产生的羟基自由基信号(峰高)明显增强，并呈一定的剂量依赖性，表明温石棉可诱导人胚肺细胞产生羟基自由基。
2.3 3种化合物对石棉诱导人胚肺细胞产生羟基自由基的影响
用柠檬酸铝、混合稀土或亚硒酸钠预处理温石棉诱导人胚肺（HEL）细胞产生羟基自由基（OH）的影响如表2~表4所示。
表2 柠檬酸铝对温石棉诱导人胚肺细胞产生羟基自由基的影响
表3 混合稀土对温石棉诱导人胚肺细胞产生羟基自由基的影响
表4 亚硒酸钠对温石棉诱导人胚肺细胞产生羟基自由基的影响
由表2～表4可见，温石棉经3种化合物预处理后，其所致人胚肺细胞产生的羟基自由基信号均明显减弱，而且其抑制率随化合物浓度的升高而增强，呈不同程度的剂量依赖性。表明用3种化合物预处理温石棉，均可抑制温石棉诱导人胚肺细胞产生羟基自由基。
3 讨论
大量的体外实验研究表明，石棉的生物学活性如细胞毒性、遗传损伤效应和细胞增殖毒性等均与其诱导的自由基产生密切相关。因此，活性氧自由基，如过氧化氢、超氧阴离子及羟基自由基等，均可能是石棉引起肺部损伤的重要介质。目前的研究发现，由于温石棉特有的表面特性，它可通过无细胞系统和有细胞系统两种途径产生活性氧。
Lim等报道，铁石棉、温石棉和青石棉均可使肺胞巨噬细胞产生活性氧，尤以温石棉作用最强，而加入激活蛋白激酶C(PKC)抑制剂可降低石棉诱导肺胞巨噬细胞产生活性氧的能力。
Shukla等认为，石棉可以通过细胞的吞噬作用或石棉纤维表面的氧化还原反应产生超氧离子，从而激活细胞内信号传导通路使基因表达，引起细胞增殖、凋亡或坏死。该研究结果表明，将温石棉与人胚肺细胞共同孵育后，随着温石棉剂量的升高，人胚肺细胞产生的羟基自由基明显增加，且呈一定的剂量依赖性，表明温石棉可诱导人胚肺细胞产生活性氧自由基。探讨其机理，可能是由于温石棉表面带有正电荷，易与细胞膜结合，通过激活细胞膜上的受体，活化磷脂酰醇信号传递系统，激活蛋白激酶C(PKC)，而PKC可使位于质膜上的能催化O2还原为O2-的NADPH氧化酶磷酸化，从而使O2-产生增多，O2-可迅速被SOD歧化为H2O2，H2O2可与温石棉表面的Fe2+发生Fenton反应生成高活性的OH。
有研究表明，羟基自由基可使细胞DNA中的脱氧鸟嘌呤羟基化，最终形成8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)，而8-OHdG在DNA合成时，可引起模板错读，从而导致DNA突变。因此，石棉诱导细胞产生的羟基自由基与其致癌性密切相关。经3种化合物预处理的同剂量温石棉所致人胚肺细胞产生的羟基自由基的量均明显下降，而且其抑制率随化合物浓度的增加而增高，呈一定的剂量依赖性，表明用3种化合物预处理温石棉，均可抑制温石棉诱导人胚肺细胞产生活性氧自由基。因此，有可能成为3种化合物抑制石棉致癌活性的重要机理之一。
4 结论
1)温石棉染毒可致人胚肺细胞产生羟基自由基，并呈一定的剂量依赖性。
2)经3种化合物预处理的温石棉其所致人胚肺细胞产生的羟基自由基信号均明显减弱。表明用3种化合物预处理温石棉，均可抑制温石棉诱导人胚肺细胞产生羟基自由基。
3)用3种化合物预处理温石棉，使温石棉诱导人胚肺细胞产生的羟基自由基减少，可能是3种化合物抑制温石棉致癌活性的重要机理之一。
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