目前对苯中毒诊断仍停留在细胞形态学和数量的检查阶段，寻找客观的预防和诊治的指标更显重要。近年大量的研究发现苯对人体血液损伤原因之一是通过损伤机体的免疫功能而发病。我们观察1例苯中毒引起的重型再生障碍性贫血（AA）患者和1例原发重型AA患者，检测发病初及骨髓恢复时的不同期间的外周血单个核细胞TCR Vβ24个亚家族基因的表达，并有10例正常人进行了比较。
一、对象与方法
（一）病例资料
病例1 患者男、27岁，广州市某鞋厂制鞋工，工龄5年，工作环境苯浓度超标，2003年12月22日以牙龈出血、鼻衄和皮下出血6d、加重2d而就诊，入院时查WBC 0.465×109/L,GRAN0.183×109/L,RBC1.84×1012/L,HGB43g/L,PLT4×109/L,RET 0.001,CD417%,CD881%,12月25日骨髓穿刺和骨髓活检诊断为“职业性慢性重度苯中毒、AA”。
病例2 患者男，19岁，待业人员。2003年10月8日以头痛、牙龈出血、心跳20天在院外诊断为“重型AA”经输血后送入院，入院时查WBC 1.5×109/L，GRAN 0.146×109/L,RBC1.43×1012/L,HGB44g/L,PLT5.57×109/L,RET 0.002,CD458%,CD833%,2003年10月10日骨髓穿刺和骨髓活检诊断为“原发性重型AA”.
2例患者在进院时和骨髓基本恢复后,例1 2004年5月12日WBC 4.0×109/L, RBC3.95×1012/L,HGB132g/L,PLT89×109/L.例2 2004年12月12WBC4.2×109/L,RBC3.50×1012/L,HGB72g/L,PLT71×109/L。分别抽血进行外周血单个核细胞TCR Vβ 24个亚家族表达的基因扫描观测并同正常人作比较。
（二）方法
1. 反转录—多聚酶链反应(RT-PCR):据Vβ 24个亚家族基因设计相应的24个Vβ特异性上游引物并在Cβ区设一Cβ下游引物,另外,在Cβ引物的左侧分别设一荧光素标记的Cβ-Fam引物(Cβ-Fam 5′-Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG)作为基因扫描之用.引物由德国TIB生物公司合成.PCR操作按常规方法进行.总反应体积为25μl,其中含1μl cD-NA,0.1 mmol/L dNTP(dATP, dCIP和dTTP),引物浓度均为0.5μmol/L(任一Vβ引物和Cβ引物),1.25U Taq聚合酶,所用试剂均为Perkin Elmer 公司产品,共进行40个循环:94℃,1min(首次3min);60℃, 1min;72℃, 1min(末次10min);结束后保存于4℃中,各反应均设阳性和阴性对照,产物于2.5%琼脂糖中电泳分析.每一受检对象分别以一Vβ(1-24)与Cβ物共进行24次PCR检测.
2. T细胞克隆性分析:(1)标记PCR产物(Rrnoff reac-tion):RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析出现阳性带者,进一步经引物Cβ-Fam进行不对称PCR扩增,以得到荧光素标记的单链PCR产物,总反应体积为10μl,含2μl首次PCR产物,0.1μmol/L Cβ-Fam,3 mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dTNP,0.25U Taq聚全酶,反应共进行35个循环,退火温度由60℃改为66℃,其余同前.(2)基因扫描分析:取荧光素(fam)标记的产物1μl,加入2.5μl甲酰胺,0.5μl标准品(ABI.GENES-CAN-500-TAMRA,其中含有不同大小的用荧光素Tamra标记的DNA片段)及0.5μl加样缓冲液(含葡聚糖蓝50mg/ml和) EDTA 25mmol/L)94℃变性4min后于6％聚丙烯酰胺凝胶，373A DNA序列分析仪(ABI，Perkin Elmer公司)中电泳及分析结果，通过分析软件672(基因扫描)分析，激光扫描及计算机收集电泳过程中不同时间所出现的不同强度和颜色的荧光素，而显示出不同位置、高度、颜色和形态的峰。峰的位置，高度和形态分别表示产物的大小、量和均一性，峰的形态可表现为单峰，主峰及个别矮峰或多峰图像；分别表示产物中所含的DNA片段大小相同。绝大多数DNA片段大小相同或DNA片段大小不一。这3种情况分别提示产物来自单克隆，寡克隆和多克隆的T细胞。
二、结果
1. RT-PCR扩增结果：(1)10例正常人外周血表达全部Vβ亚家族T细胞呈多峰图像，即多克隆性。(2)苯中毒再障和原发性再障患者在病情不同阶段表达有所不一，表现为在发病初期苯中毒患者只有Vβ4、Vβ12不表选，原发性再障患者则出现Vβ2、Vβ6、Vβ11、Vβ17、Vβ18、Vβ20、Vβ22、Vβ23和Vβ24等9个亚家族不表达，明显不同于苯中毒患者。(3)在
治疗后骨髓基本恢复时可见苯中毒患者出现有5个不表达．(Vβ4、18、20、22、24)原发性再障患者仅有3个不表达(Vβ4、12、24)。
2.基因扫描分析结果：10例正常人所有PCR产物均呈多峰图像(多克隆性)。在苯中毒再障初期，Vβ1、6、15、18、20表达为单峰图像(寡克隆性)，Vβ5、10、11、13为寡克隆趋势V24表达双克隆，余表达多克隆性。原发再障患者初期仅在Vβ21表达为双克隆，余为多克隆。在骨髓得到恢复后查，可见苯中毒所致再障患者PCR产物回复到多克隆和寡克隆趋
势的表达，原发再障患者表达明显增加外，除Vβ1为寡克隆趋势外，余均为多克隆表现。在未受任何抗原刺激情况下，正常人外周血T细胞应该来自各亚群，呈多克隆。
三、讨论
1在未受任何抗原刺激情况下，所有Vβ家族均存在于外周血中，基因扫描提示各产物呈多峰图像，即为多克隆性。在特异性抗原刺激下，机体TCR的重排出现了选择性，产生
特异的有针对性的亚家族T细胞，引起机体相应的细胞免疫反应，表现为TCR Vβ亚家族分布的不均匀性和出现克隆性增殖的T细胞，基因扫描出现寡克隆表达，表现为单峰图像，即寡克隆性。双峰图像，即双克隆性，在免疫功能受损或重建未健全时，部分亚家族的T细胞表达缺失。该方法目前已在肿瘤和免疫性疾病研究中得到广泛应用。我们也在国内首先将该方法用于苯中毒患者的研究。
2.我们的前期研究曾分析了苯接触对TCR Vβ亚家族基因谱系的影响情况。本次研究进一步观察到苯中毒所致AA和原发性AA患者从发病初期到恢复过程的外周血T细胞克隆性的表达与正常人三者各有匹别，10例正常人T细胞24个亚家族与文献报道一样为全表达并呈多克隆性，但苯中毒AA和原发性AA在TCR基因表达谱系上有所差别。在苯中毒AA患者发病初期仅出现Vβ4和Vβ12缺失，可能为苯毒性作用引起机体相应的细胞免疫反应，产生优势的克隆性T细胞而影响其它亚家族T细胞的表达所致。但在原发AA初期患者出现了Vβ2、6、11、17、18、20、22、23、24共9个亚家族缺失，这可能提示原发AA患者免疫功能紊乱而表现为部分TCR Vβ亚家族T细施的增殖失调。如文献报道的骨随移植后的患者一样，在其免疫功能受到破坏或重建未健全时，基园扫描同样表现为部分亚家族的表达缺失。在原发AA患者骨随恢复后，可见Vβ亚家族的表达恢复增多，这与近年采用抗胸腺球蛋白和环胞素改善机体免疫功能治疗原发AA患者通过改善T细胞亚家族功能而取得明显效果的结果相一致。
3.在克隆增殖方面，从基因扫描结果可看到苯中毒所致AA患者初期出现9个寡克隆→寡克隆趋势的表达，一个双克隆表达(Vβl、5、6、10、11，13、15、18、20、24)，有别于原发AA患者的表达。这可能是苯的免疫损伤刺激作用引起机体相应的细胞免疫反应。经治疗后，苯毒性得到控制时，机体免疫功能逐渐得以修复，寡克隆的表达渐恢复为多克隆。
本研究通过基因扫描分析初步比较了苯致AA与原发AA患者T细胞克隆性的表达差异情况，虽然仅观察了各例患者，但看到患者从发病初期T细胞克隆增殖模式有所不同，为临床上采用免疫治疗提供了参考，同时也为我们进一步开展相关研究积累了依据。
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